毒理學實驗

本研究中進行的所有實驗，斑馬魚胚胎（AB品系）的維持如先前報道所述。受精后立即收集胚胎，并分選以去除糞便和不育卵。然后，將收集的胚胎從受精后2.5小時（hpf）至72 hpf暴露于96孔板中的HA、GO或GO-HA。為了達到與先前發育毒性研究相當的碳納米材料劑量，將懸浮液（[GO]=0-100 mg/L；[HA]=0-100 mg/L）制備在E3培養基（5 mM NaCl,0.33 mM CaCl2,0.17 mM KCl,0.33 mM MgSO4,pH 7.4）中。每天分析胚胎，并通過光學顯微鏡（Olympus ZL 61,Olympus,Japan）在毒性終點記錄存活率、心率和畸形。超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的活性以及丙二醛（MDA）的含量按照先前報道的方法進行分析。羥基自由基（·OH）在室溫（296 K）下使用DMPO捕獲，并使用電子順磁共振（EPR）波譜儀（Magnettech MiniScope 400,Germany）進行定量。使用Unisense氧微傳感器測量卵膜間隙的氧濃度。基于FT-IR光譜（Bruker Tensor 27,Germany）記錄蛋白質和DNA的生化成分含量。分別使用DCFH-DA和JC-1熒光染色，通過熒光顯微鏡（Olympus X71;Olympus,Japan）測量ROS的產生和線粒體膜電位的損失。使用TEM（Hitachi HT7700,Japan）研究細胞超微結構和卵膜變化，并使用780 nm激光的RS（Thermo Scientific,DXR）分析TEM圖像中可疑的GO包含區域以確認GO。詳細信息見支持信息。GO在塑料和玻璃孔板上的吸附、GO的體內吸收以及蛋白質羰基和8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-OHdG）的測量見支持信息。

數據分析

胚胎的TEM和熒光顯微鏡圖像使用ImageJ分析。FT-IR光譜使用Origin 8.5和Peak Fit v4.12軟件分析。使用IBM SPSS 22.0統計軟件進行統計分析。除非另有說明，每個實驗進行三次或更多重復。采用Dunnett檢驗的單因素方差分析分析p<0.05的顯著性水平。除非另有說明，數據表示為平均值±標準差（SD）。

結果

GO和HA的特性

原子力顯微鏡成像表明GO納米片的厚度約為0.8-1.2 nm，觀察到尖銳的鋸齒狀邊緣。SEM和TEM圖像、流體動力學直徑、Zeta電位、表面化學和RS譜見GO與HA相互作用部分。HA包含77.85%C 1s,20.49%O 1s和1.66%N 1s。TEM和AFM圖像顯示HA的直徑范圍約為2至12 nm（中心約7 nm）。表明HA涉及的功能基團和化學鍵有C=C,C-O,C-N,C-C,O-C=O,C-H和O-H。

HA減輕了GO毒性

研究了有和沒有HA的情況下GO對斑馬魚胚胎發育的影響。在對照組中，孵化率、心包水腫和心率分別為78.0±4.7%、4.8±1.5%和160.0±9.0次/分鐘。與對照組相比，僅HA（0.01-100 mg/L）未對胚胎發育誘導顯著不利影響。然而，100 mg/L GO（GO100）與對照組相比確實誘導了胚胎的顯著毒性（p<0.05），孵化率、心包水腫和心率分別從78.0±4.7%、4.8±1.5%和160.0±9.0次/分鐘變為37.0±5.0%、34.8±11.7%和197.0±14.0次/分鐘。相比之下，在10 mg/L HA存在下，孵化率、心包水腫和心率分別恢復至70.0±8.0%、7.6±2.3%和168.0±11.0次/分鐘，這表明GO100對斑馬魚胚胎發育的不利影響被顯著減輕（p<0.05）。此外，表明GO和GO-HA在塑料和玻璃孔板上均無顯著吸附（p>0.05），證實GO毒性的減輕是由HA引起，而非由于在塑料和玻璃壁上的吸附增加所致。

圖1.絨毛膜與GO/GO-HA的相互作用。(a-d)透射電子顯微鏡圖像。(c)和(d)分別為(a)和(b)的放大圖(n=3)。綠色箭頭指示絨毛膜與GO/GO-HA的相互作用界面。紅色箭頭指示絨毛膜與納米材料之間的電子密度。In，絨毛膜內部空間；Po，絨毛膜孔道；Out，絨毛膜外部環境。(e)通過測量絨毛膜與GO連接線長度與絨毛膜總長度的比值，分析TEM圖像中絨毛膜與納米材料的相互作用界面。每組處理組的三個胚胎共分析六張TEM圖像。*表示在p<0.05水平顯著。(f)絨毛膜中的氧濃度。*表示n=6時在p<0.05水平顯著。GO，100 mg/L氧化石墨烯；HA，10 mg/L腐殖酸。

HA對GO與卵膜相互作用的影響

卵膜作為抵御外部風險的第一道屏障，直接接觸納米顆粒。因此，使用TEM和FT-IR檢測了在HA存在和不存在的情況下GO與卵膜的相互作用。在沒有HA的情況下，GO粘附并包裹卵膜，形成厚度約50至600 nm的層；在HA存在下，厚度約800至1200 nm。測量TEM圖像中卵膜與GO之間連接線長度與卵膜總長度的比率，以分析卵膜與納米材料之間的相互作用界面。在沒有HA的情況下，相互作用界面的比率為86.7%，而在HA存在下顯著降至26.4%（p<0.05）?？梢钥闯?，卵膜與GO之間的電子致密結構寬度約為20 nm。然而，卵膜與GO-HA之間的電子致密結構不明顯。此外，使用微傳感器分析了卵膜間隙內的氧濃度。在對照樣品中，卵膜附近的氧濃度為269μM，當傳感器插入深度250μm接近胚胎時，卵膜間隙內的氧濃度逐漸降至266μM。與對照結果相似，GO-HA組的氧濃度隨深度增加略有下降，從270μM降至264μM。在暴露于100 mg/L GO的胚胎中，氧濃度顯著下降，在100和250μm深度記錄到的濃度分別為233和227μM。這些數據表明，GO對卵膜的緊密包裹在卵膜內產生了缺氧環境。相反，在HA存在下，卵膜是氧合的，未表現出顯著的缺氧現象。以上結果表明卵膜與GO之間的相互作用比卵膜與GO-HA之間的相互作用更強烈。

圖2.腐植酸（HA）對氧化石墨烯（GO）誘導卵殼損傷的影響。（a）通過電子順磁共振譜測定的羥基自由基生成量。S I表示電子順磁共振譜的信號強度。每個處理組包含40個胚胎。（b）GO/GO-HA與卵殼相互作用的透射電鏡圖像。（c）卵殼突起的半定量分析。相對數量是指納米材料處理組與對照組中突起數量的比值。綠色箭頭指示卵殼突起。每個處理組取三個胚胎的六張透射電鏡圖像進行分析。*表示在p<0.05水平上具有顯著性。（d）卵殼蛋白質二級結構的變化。每個處理組包含25個胚胎。*表示在p<0.05水平上具有顯著性，n=3。Cho：卵殼；GO：100 mg/L氧化石墨烯；HA：10 mg/L腐植酸。