摘要：氧化石墨烯（GO）是一種廣泛使用的碳質(zhì)納米材料。迄今為止，天然有機(jī)質(zhì)（NOM）對GO在水生脊椎動物中毒性的影響尚未見報道。在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中，GO誘導(dǎo)了顯著的孵化延遲和心包水腫。GO與卵膜的強(qiáng)烈相互作用導(dǎo)致卵膜突起損傷、過量羥基自由基（·OH）的產(chǎn)生以及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變。相比之下，腐殖酸（HA）作為NOM的一種普遍形式，顯著減輕了上述不利影響。HA減少了GO與卵膜之間的相互作用，并通過調(diào)節(jié)GO的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和表面負(fù)電荷來減輕卵膜損傷。HA還改變了GO的吸收和沉積，并減少了GO在胚胎卵黃細(xì)胞和深層細(xì)胞中的聚集。此外，HA減輕了GO誘導(dǎo)的線粒體損傷和氧化應(yīng)激。這項(xiàng)工作揭示了在NOM存在下GO的一種可行的解毒機(jī)制，并避免高估GO在自然環(huán)境中的風(fēng)險。

引言

氧化石墨烯（GO）作為石墨烯家族納米材料的代表，因其優(yōu)異的性能和可大規(guī)模低成本生產(chǎn)而在環(huán)境應(yīng)用中引起了廣泛關(guān)注，例如作為廢水和飲用水處理的吸附劑、水體有機(jī)染料的催化劑、固相萃取的功能材料以及脫鹽膜。GO的上述應(yīng)用使其不可避免地釋放到水環(huán)境中。體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)均表明GO可能誘導(dǎo)毒理學(xué)效應(yīng)（包括遺傳毒性和細(xì)胞毒性），GO釋放到生態(tài)系統(tǒng)中無疑增加了其環(huán)境風(fēng)險。一些研究人員提到了在有機(jī)抗氧化劑（例如抗壞血酸和多酚）存在下GO類材料毒性的變化。天然有機(jī)質(zhì)（NOM）是水環(huán)境的重要組成部分，納米材料與NOM的相互作用將是決定其在環(huán)境中歸宿的主要因素。與抗壞血酸和多酚相比，腐殖酸（HA）作為NOM的主要成分，含有親水基團(tuán)，具有顯著調(diào)節(jié)納米材料環(huán)境行為和毒性的能力。盡管關(guān)于HA對碳納米管毒性影響的了解甚少，但已有研究表明，由于C60的尺寸效應(yīng)和表面電荷變化，HA能減少大型溞和斑馬魚對富勒烯（C60）的吸收。類似地，由于HA的吸附，CeO2納米顆粒對秀麗隱桿線蟲的毒性降低。然而，HA吸附增加了TiO2納米顆粒在水體中的懸浮穩(wěn)定性和停留時間，從而增加了對自由游動水生生物的暴露和毒性。此外，HA在水環(huán)境中既可作為活性氧（ROS）的來源也可作為其匯。因此，HA很可能具有顯著改變GO在水環(huán)境中納米毒性的潛力。

胚胎發(fā)生是生命的關(guān)鍵階段，功能失調(diào)的胚胎發(fā)生與疾病和不良效應(yīng)相關(guān)，如氧化應(yīng)激、畸形、器官功能障礙和死亡。一些研究調(diào)查了碳基納米材料與胚胎的相互作用。例如，暴露于50 mg/L GO的斑馬魚胚胎表現(xiàn)出顯著的孵化延遲，并且在孵出的幼體中觀察到形態(tài)缺陷。類似地，多壁碳納米管誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)顯著的發(fā)育延遲以及大腦、脊索、眼睛和卵黃囊異常。在這些研究中，大部分注意力集中在原始碳基納米材料對胚胎發(fā)生的影響上。然而，關(guān)于在NOM存在下毒性的變化和機(jī)制卻鮮有報道。卵膜是包圍硬骨魚成熟卵的無細(xì)胞包膜，是抵御納米顆粒的第一道屏障。各種研究提出，納米材料穿透或被卵膜吸附，對胚胎發(fā)生產(chǎn)生負(fù)面影響。然而，卵膜與石墨烯家族納米材料的相互作用機(jī)制尚不清楚，尤其是在NOM存在的情況下。

為了評估自然水生系統(tǒng)中的納米毒性，一種選擇是開發(fā)一種多層次的方法來測量納米材料的毒性。本文研究了胚胎發(fā)育、納米材料-卵膜界面相互作用、納米材料的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化酶活性、線粒體損傷、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變以及納米材料與HA的相互作用。這項(xiàng)工作提出了在HA存在下硬骨魚胚胎可行的解毒途徑。

材料與方法

材料

GO（純度99%）購自中國南京先豐納米材料科技有限公司，采用經(jīng)典的Hummers方法合成。HA（生物級，從褐煤中提取）購自中國上海匯成生物科技有限公司。5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）、5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基咪唑羰花青碘化物（JC-1）和2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購自Sigma-Aldrich。其他化學(xué)試劑為光譜級或分析級。

GO與HA的相互作用

鑒于HA易于在堿性環(huán)境中溶解，將HA懸浮液（500 mg/L）先用1 M NaOH調(diào)節(jié)至pH 11.0，然后在1200 rpm下磁力攪拌2小時，之后溶液通過0.45μm聚四氟乙烯膜過濾。然后制備進(jìn)一步的HA溶液（100 mL,10 mg/L，用1 M HCl調(diào)節(jié)至pH=7.4），并與0.01 g GO輕柔混合24小時（光照/黑暗=14小時/10小時）。隨后，將懸浮液離心（3500g，30分鐘）并過濾（0.2μm聚四氟乙烯膜），在用水輕柔洗滌后收集雜交的GO-HA。使用多種技術(shù)表征HA、GO和GO-HA。原子力顯微鏡（AFM）圖像使用Agilent 5420 AFM儀器（Agilent,CA）以輕敲模式獲得。掃描電子顯微鏡（SEM）使用Hitachi SU8010顯微鏡（日本）進(jìn)行。透射電子顯微鏡（TEM）圖像使用Hitachi HT7700高分辨率透射電子顯微鏡（日本）記錄。使用514 nm激光（Thermo Scientific,DXR）的拉曼光譜（RS）分析GO和GO-HA的結(jié)構(gòu)。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）譜圖在Bruker Tensor 27紅外光譜儀上記錄，分辨率2 cm-1，步長從4000到400 cm-1。Zeta電位和流體動力學(xué)直徑通過動態(tài)光散射使用30 mW,657 nm激光（ZetaPALS,Brookhaven,USA）獲得。X射線光電子能譜（XPS）測量使用Axis Ultra XPS系統(tǒng)（Kratos）進(jìn)行，配備單色Al KαX射線源（1486.6 eV）。使用CasaXPS v2.3.13軟件分析譜圖。