卵膜損傷

通過DMPO捕獲卵膜附近的·OH并通過EPR測定。在經納米材料處理的樣品中檢測到強烈的·OH信號，而在HA存在下信號強度顯著降低，表明HA減少了·OH的產生。可以看出，在GO100處理的樣品中，卵膜表面的突起不規則且變形，相對數量降至未處理樣品中數量的42.0%。相比之下，在HA存在下，突起規則且完整，未處理樣品中的數量增加至84.2%。這些數據表明GO與卵膜之間的相互作用引發了·OH的產生并導致卵膜損傷，但這些效應被HA減輕。FT-IR光譜是確定生化成分、蛋白質模式和二級結構的有力工具。列出了根據先前報告的各種FT-IR譜帶的暫定歸屬。如圖所示，在對照組中，卵膜中α-螺旋、β-折疊、無規卷曲以及轉角和平彎的百分比分別為15.7±2.3%、52.6±4.4%、16.1±1.5%和15.6±1.3%，并且這些蛋白質二級結構未受到10 mg/L HA的顯著干擾（p>0.05）。在GO暴露下，β-折疊以及轉角和平彎的百分比分別增加至67.3±5.2%和24.2±1.7%，而α-螺旋降至8.5±1.1%，無規卷曲完全消失。然而，在HA存在下，蛋白質二級結構的改變恢復，與對照組相比無顯著差異（p>0.05）。1543 cm-1（酰胺II）和1681 cm-1（酰胺I）處的譜帶強度比（I1543/I1681）與整體蛋白質模式組成相關。在對照組、GO組和GO-HA組中，I1543/I1681比值分別為0.97、0.60和1.05。這些結果證實HA減少了GO誘導的卵膜損傷。

圖3.HA對斑馬魚胚胎攝取和轉運GO的影響。(a)暴露于GO的卵殼透射電鏡圖像(n=3)。(b)暴露于GO-HA的卵殼透射電鏡圖像(n=3)。(c)暗沉積物面積與卵殼總面積的比值。每個處理組取三個胚胎的六張TEM圖像進行分析。*表示p<0.05水平顯著。(d-f)斑馬魚胚胎內GO轉運的透射電鏡圖像(n=3)。(g)胚胎拉曼光譜(n=3)。綠線標示卵殼孔道區域，紅色箭頭指示納米材料。In表示卵殼內部空間；Por表示卵殼孔道；Out表示卵殼外部環境；GO為1 mg/L氧化石墨烯；HA為0.1 mg/L腐植酸。比例尺為1μm。

納米材料的吸收和轉運

使用TEM結合RS（在胚胎中觀察到GO特定的D和G帶）檢測GO和GO-HA的吸收和轉運。GO1（1 mg/L GO）和GO1-HA（1 mg/L GO與0.1 mg/L HA）均穿透了卵膜。然而，通過卵膜孔進入卵膜的GO-HA比GO多，這通過使用激光掃描共聚焦顯微鏡對FITC標記的GO進行實時監測的結果得到進一步證實。與對照組相比，在GO處理的樣品胚胎的卵黃細胞和深層細胞中存在明顯的暗色沉積物。在GO-HA處理的樣品中，這些暗色沉積物的尺寸變小，并且主要位于胚胎的上皮包被層細胞中。通過RS觀察到的顯著G和D帶證實暗色沉積物是GO。此外，當胚胎與GO一起孵育或在4.0°C下孵育時，卵膜的整體蛋白質模式發生顯著變化，表明卵膜的蛋白質模式可能因納米材料刺激和低溫而改變。

HA對GO誘導的線粒體毒性的影響

通過TEM研究了GO和GO-HA誘導的線粒體毒性。在胚胎細胞中，對照組和GO100-HA組中的線粒體規則分散并顯示完整結構。然而，在GO100暴露下，線粒體變得腫脹和松散，膜和嵴的完整性受損。這些結果表明HA可以降低GO的線粒體毒性。此外，JC-1染色證實了這一假設。對照組和GO100-HA組的圖像以紅色熒光（健康線粒體）為主，相應的590 nm強度與520 nm強度之比（I590/I520）分別為6.7和6.3。相比之下，暴露于GO100的胚胎表現出強綠色熒光（受損線粒體），I590/I520比值降至1.8。以上結果表明HA減輕了GO誘導的線粒體毒性。

HA對GO誘導的氧化應激的影響

與對照組相比，10 mg/L HA在72 hpf內未顯著改變SOD、GSH、MDA或ROS水平。GO100顯著增加了GSH、MDA和ROS水平，并抑制了SOD活性。相比之下，GO-HA引發了較低的氧化應激，這與FT-IR結果一致。如圖所示，與對照組和GO-HA組相比，GO處理胚胎中2853 cm-1處的-CH2峰降低，表明長鏈結構因GO暴露而裂解。1681和1025 cm-1處的峰均減弱，暗示GO處理樣品中存在蛋白質和DNA損傷，這分別得到蛋白質羰基和8-OHdG顯著增加的支持（p<0.05）。相反，HA減少了GO在胚胎中誘導的脂質、蛋白質和DNA損傷。