GO與HA的相互作用。如圖S17（支持信息）所示，與GO譜圖相比，GO-HA的C=C基團(tuán)出現(xiàn)約40 cm?1的藍(lán)移（從1608 cm?1移至1645 cm?1），且1396 cm?1處的羥基峰強(qiáng)度減弱。傅里葉變換紅外光譜表明HA可能通過π-π相互作用定位于GO的sp2平面，這與Hu等人關(guān)于石墨烯的研究以及Yang等人關(guān)于少層還原氧化石墨烯的結(jié)論一致。為進(jìn)一步分析GO與HA的相互作用，進(jìn)行了透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）測試。圖4a、b及支持信息中的圖S1、S18顯示，GO片層光滑透明，而GO-HA在納米片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)與顆粒。在透射電鏡（TEM）和掃描電鏡（SEM）圖像中分別可見。此外，氧化石墨烯（GO）片層邊緣變得平滑，厚度范圍收窄至2.0-8.9納米。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了腐植酸（HA）在GO片層表面的固定作用。圖4c所示的拉曼光譜（RS）中，G峰和D峰分別對應(yīng)GO的sp2（1358 cm?1）和sp3（1695 cm?1）碳體系。GO與GO-HA的D/G峰強(qiáng)度比分別為0.88±0.03和0.76±0.02，表明HA的吸附顯著降低了GO的無序結(jié)構(gòu)（p<0.05）。通過動(dòng)態(tài)光散射測定Zeta電位（分散性）顯示（圖4d），GO和GO-HA的Zeta電位隨pH值升高而降低，說明兩種材料在E3溶液中pH 2.0-12.0范圍內(nèi)表面均帶負(fù)電荷。Zeta電位結(jié)果還表明GO-HA比GO帶有更多負(fù)電荷且分散性更佳。粒徑分布結(jié)果（圖4e）顯示GO和GO-HA的粒徑分布范圍分別為192.8-531.25 nm（平均尺寸323.2±23.7 nm）和220.2-481.4 nm（平均尺寸356.1±29.1 nm）。24小時(shí)后，GO和GO-HA的平均尺寸分別增至825.8 nm和394.4 nm。上述結(jié)果證實(shí)HA通過增加表面負(fù)電荷增強(qiáng)了GO的分散性。

圖4. GO與HA的相互作用。(a) GO-HA的透射電鏡圖像；(b) GO和GO-HA的掃描電鏡圖像；(c) GO-HA的原子力顯微鏡圖像；(d) GO和GO-HA的拉曼光譜；(e) Zeta電位隨pH的變化；(f) GO和GO-HA在0和24小時(shí)的尺寸分布變化。綠色箭頭指示HA。

討論

為了探索HA對GO納米毒性的影響，研究了GO/GO-HA與卵膜界面的相互作用、卵膜蛋白的改變、納米材料的吸收和沉積以及線粒體毒性和氧化應(yīng)激。測試的HA濃度（0.01-100 mg/L）具有環(huán)境相關(guān)性。本研究指出HA大大降低了GO的潛在風(fēng)險(xiǎn)。斑馬魚卵膜由糖基化蛋白質(zhì)組成，保護(hù)胚胎并作為抵御納米顆粒的第一道屏障。在本研究中，觀察到GO緊密粘附在卵膜表面，相互作用界面高達(dá)86.7%，這阻塞了卵膜孔并導(dǎo)致卵膜間隙內(nèi)出現(xiàn)缺氧微環(huán)境。缺氧在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中誘導(dǎo)缺血、孵化延遲和畸形。ROS不是納米毒性的唯一因素，并且在細(xì)菌和精子中也發(fā)現(xiàn)了GO對生物體表面的包裹。因此，將胚胎困在聚集的GO片中以使其與環(huán)境隔離被認(rèn)為是GO對生物體毒性的可能機(jī)制。然而，在HA存在下，GO與卵膜的相互作用界面變得松散并顯著減少，卵膜間隙內(nèi)的氧濃度恢復(fù)正常水平。相應(yīng)地，在GO-HA孵育的胚胎中，孵化率增加，心包水腫發(fā)生率降低。

此外，在GO處理的胚胎中，卵膜的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)被顯著改變。在這些胚胎中觀察到的β-折疊結(jié)構(gòu)增加和α-螺旋結(jié)構(gòu)減少與鉛、氰化物和輻射暴露的不利效應(yīng)相似。早期工作表明，蛋白質(zhì)中所有組成氨基酸側(cè)鏈都易受自由基影響，并且它們的二級結(jié)構(gòu)可能因自由基攻擊而改變。在本研究中，產(chǎn)生的·OH可能攻擊了蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變。此外，GO的g值為2.0031，與自由電子（2.0023）相似，表明GO由于碳缺陷（如懸空鍵以及邊緣或內(nèi)部平面上的轉(zhuǎn)折和扭結(jié)）具有觸發(fā)ROS形成的潛力。相反，在HA存在下，·OH的產(chǎn)生和GO-HA與卵膜的相互作用界面顯著減少。相應(yīng)地，暴露于GO-HA的胚胎中卵膜蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)恢復(fù)。此外，卵膜突起被GO破壞并在HA存在下恢復(fù)。綜上所述，這些結(jié)果表明HA顯著減輕了GO誘導(dǎo)的卵膜損傷。

卵膜中的自然孔徑約為0.5至1μm，這足夠大以允許許多納米顆粒進(jìn)入卵膜囊。鑒于TEM圖像中的尖銳邊緣和GO優(yōu)異的機(jī)械性能，GO容易通過孔隙穿透生物膜進(jìn)入卵膜，這已被廣泛提出。HA固定化后，GO的厚度增加，鋸齒狀邊緣消失并增強(qiáng)折疊；膜穿透被減輕，導(dǎo)致GO-HA的吸收主要通過卵膜孔進(jìn)行。此外，GO誘導(dǎo)的卵膜損傷，如蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變和突起的塌陷，促進(jìn)了納米材料在卵膜囊中的吸收。相比之下，在HA存在下，進(jìn)入卵膜囊的GO較少，如TEM、RS和共聚焦顯微鏡所示。這些數(shù)據(jù)暗示卵膜可能具有控制GO和GO-HA吸收的潛力。為了檢查GO-HA吸附到塑料孔板上的可能性，研究了GO-HA在塑料孔板上的吸附。支持GO-HA在塑料孔板上沒有明顯吸附，表明GO-HA在塑料孔板上的吸附不能解釋胚胎對GO吸收的減少，并且卵膜控制了GO的吸收。最近的一份報(bào)告發(fā)現(xiàn)，除了作為物理屏障外，卵膜還是一種化學(xué)反應(yīng)性膜，可控制銀的原位形態(tài)，支持我們的提議。此外，卵膜可能通過整體蛋白質(zhì)模式的變化來響應(yīng)外部刺激，這可能涉及一個(gè)生化過程，盡管潛在機(jī)制尚不清楚。然而，這些數(shù)據(jù)表明HA可以調(diào)節(jié)GO的形態(tài)和吸收，增強(qiáng)卵膜的保護(hù)作用，并降低GO在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中的毒性。

納米材料進(jìn)入胚胎后，GO和GO-HA表現(xiàn)出不同的沉積模式。GO的聚集在胚胎的卵黃細(xì)胞和深層細(xì)胞中很明顯。相比之下，GO-HA沉積物更小更少，并且主要位于上皮包被層細(xì)胞中，這些細(xì)胞起保護(hù)作用并抑制周皮的獨(dú)有生成。與上皮包被層細(xì)胞相比，卵黃細(xì)胞和深層細(xì)胞在胚胎發(fā)生中起重要作用。前者在早期階段提供營養(yǎng)并介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，后者是胚胎發(fā)生的主要區(qū)域。這些數(shù)據(jù)表明HA的存在導(dǎo)致GO易位到相對不重要的組織，這與HA介導(dǎo)的增強(qiáng)石墨烯在小麥液泡中的儲(chǔ)存一致。易位機(jī)制可能涉及納米材料的形狀和親水性，因?yàn)镚O表現(xiàn)出更好的親脂特性和尖銳的鋸齒狀邊緣，因此可能比GO-HA更容易穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞質(zhì)中聚集。

GO包裹引起的缺氧和具有鋸齒狀邊緣的物理損傷都可能導(dǎo)致線粒體損傷。事實(shí)上，100 mg/L GO確實(shí)誘導(dǎo)了顯著的線粒體損傷，而HA顯著減輕了上述不利影響。此外，建議保持石墨烯基材料的穩(wěn)定分散以最小化其毒性。Zeta電位表明GO-HA在生理相關(guān)pH范圍6-10內(nèi)比GO表現(xiàn)出更多的負(fù)電荷并且更穩(wěn)定。因此，GO-HA也可能通過增加表面負(fù)電荷并減少其通過電荷排斥與胚胎、線粒體和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的接觸來降低GO在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中的毒性。

線粒體損傷與自由基生成及氧化應(yīng)激增強(qiáng)密切相關(guān)，這已被提出作為納米毒性的主要機(jī)制。在氧化石墨烯暴露組中，胚胎內(nèi)活性氧（ROS）生成量較對照組和GO-HA組顯著增加（p<0.05），這可能破壞由酶性和非酶性防御系統(tǒng)維持的自由基動(dòng)態(tài)平衡。一致地，與對照組和GO-HA組相比，GO顯著誘導(dǎo)SOD水平升高和GSH水平降低（p<0.05）。此外，傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）結(jié)果表明，經(jīng)GO處理的胚胎中DNA和蛋白質(zhì)均受損，這與蛋白質(zhì)羰基化和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）加合物的數(shù)據(jù)一致。近期研究顯示GO會(huì)引發(fā)斑馬魚DNA中8-OHdG修飾，與我們的結(jié)果相符。然而在腐植酸（HA）存在的情況下，GO引發(fā)的上述負(fù)面效應(yīng)得到緩解，且測試的抗氧化酶活性得以恢復(fù)。這些數(shù)據(jù)表明HA通過修復(fù)線粒體損傷來降低GO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

環(huán)境影響

本研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸（HA）改變了氧化石墨烯（GO）的表面形態(tài)，并提高了其在生理和環(huán)境相關(guān)pH值范圍6-10下的穩(wěn)定性。HA通過減弱GO與卵殼膜的相互作用，恢復(fù)了胚胎卵殼微環(huán)境中的氧含量。此外，HA影響了GO的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，表明其對硬骨魚胚胎發(fā)生具有解毒作用。HA減輕了GO誘導(dǎo)的胚胎線粒體損傷、形態(tài)學(xué)改變及氧化應(yīng)激。上述結(jié)果表明HA改變了GO的命運(yùn)和生物響應(yīng)。鑒于HA在天然水體中的廣泛分布，其可作為GO的天然解毒劑。本研究也提示，此前未考慮HA暴露的納米材料生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估研究需要重新審視。