泥火山、泥漿池和噴氣孔是顯著的地質(zhì)特征，其特點(diǎn)是釋放氣體、水和/或半液態(tài)泥漿基質(zhì)，并伴有大量甲烷向大氣排放（每年10-1至103噸）。這些地區(qū)的環(huán)境條件從環(huán)境溫度和中性pH到高溫和低pH不等。盡管有強(qiáng)烈跡象表明泥火山中存在生物甲烷消耗，但目前已知的甲烷氧化細(xì)菌無法在噴氣孔的惡劣條件（溫度高達(dá)70°C，pH低至1.8）下繁殖。好氧甲烷氧化的第一步由可溶性或膜結(jié)合甲烷單加氧酶催化。本文報(bào)道，利用從Solfatara火山泥漿池和噴氣孔周圍裸露土壤提取的DNA構(gòu)建的pmoA（編碼膜結(jié)合甲烷單加氧酶的β亞基）克隆文庫(kù)，顯示出新穎且差異顯著的pmoA基因簇。在50°C和pH 2.0條件下進(jìn)行甲烷氧化富集培養(yǎng)后，培養(yǎng)物中代表了差異性最大的簇，與任何其他已描述的pmoA基因同源性低于50%。最終，我們分離出一種嗜酸甲烷氧化細(xì)菌Acidimethylosilex fumarolicum SolV，屬于Planctomycetes/Verrucomicrobia/Chlamydiae超門，位于包含已知甲烷氧化菌的Alpha和Gammaproteobacteria亞門之外。該細(xì)菌在氧氣限制下以甲烷為唯一能源生長(zhǎng)，最低pH可達(dá)0.8，遠(yuǎn)低于任何先前描述的甲烷氧化菌的最適pH。A.fumarolicum SolV具有三個(gè)不同的pmoA基因，其中兩個(gè)與從泥漿池獲取的序列高度相似。來自黃石公園的高度同源環(huán)境16S rRNA基因序列表明，這種新型甲烷氧化細(xì)菌可能是極端環(huán)境的常見居民。這是首次將廣泛分布的疣微菌門（其大多數(shù)成員尚未培養(yǎng)）與地球化學(xué)相關(guān)反應(yīng)聯(lián)系起來。

地殼內(nèi)產(chǎn)生的大量地質(zhì)甲烷目前自然釋放到大氣中。這些甲烷排放的初步全球估計(jì)表明，可能存在足夠多的來源來提供全球甲烷疑似缺失源所需的量。最近對(duì)Haakon Mosby和Carpathian泥火山的研究表明，這些系統(tǒng)也可能作為這種地質(zhì)甲烷的匯。在這些環(huán)境條件適中（2-25°C，中性pH）的地點(diǎn)，存在好氧和厭氧甲烷氧化微生物的16S rRNA基因。相比之下，如位于那不勒斯附近Pozzuoli的Solfatara的噴氣孔，也排放大量甲烷（每年每平方公里73噸CH4），其特征是土壤pH低（低至1.0）和溫度高（高達(dá)70°C）。這些地點(diǎn)的富含H2S的含硫煙霧被微生物氧化成硫酸，形成極度酸性環(huán)境。Solfatara的極酸性土壤被證明支持顯著的甲烷消耗，但迄今為止尚不清楚哪些微生物可能負(fù)責(zé)這種消耗。專性好氧甲烷氧化菌被認(rèn)為是一類獨(dú)特的細(xì)菌，屬于Proteobacteria的Alpha或Gamma亞類，它們使用甲烷作為唯一的能源和碳源。迄今為止，所有好氧甲烷氧化菌都被證明含有膜結(jié)合顆粒甲烷單加氧酶（pMMO），除了Methylocella sp.被報(bào)道僅含有可溶性、胞質(zhì)形式的MMO（sMMO）。pmoA基因（編碼這種膜結(jié)合MMO的24 kDaβ亞基）通常用作甲烷氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。甲烷氧化菌在自然界廣泛分布，多為嗜中溫和中性pH。然而，基于分子調(diào)查，過去十年開始分離和表征更多極端嗜性蛋白細(xì)菌甲烷氧化菌。迄今為止，報(bào)道的仍支持甲烷氧化活性的最低pH值來自從泥炭沼澤分離的細(xì)菌。這些細(xì)菌屬于Proteobacteria的Alpha亞類（Methylocella、Methylocapsa和Methylocystis屬），在pH 4.2至7.5之間生長(zhǎng)，最大甲烷氧化活性約在pH 5.0。

方法摘要

富集培養(yǎng)始于索爾法塔拉地區(qū)的泥漿和混合土壤樣本，在50°C、pH 2.0條件下以甲烷作為唯一能量源和碳源進(jìn)行培育。當(dāng)觀察到甲烷消耗后，開始進(jìn)行連續(xù)傳代至新鮮培養(yǎng)基。最終通過浮游濾膜技術(shù)17獲得純培養(yǎng)物。采用FISH技術(shù)及在無甲烷頂空條件下添加酵母提取物的培養(yǎng)基平板驗(yàn)證純度。環(huán)境樣本DNA和SolV菌株基因組DNA的提取方法參照文獻(xiàn)28，分別使用引物A189與A682、616F（5'-AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3'）與630R（5'-CAK AAAGGAGGTGAT CCC-3'）28通過熱啟動(dòng)法擴(kuò)增pmoA和16S rRNA基因。基因組DNA的焦磷酸測(cè)序按文獻(xiàn)18方法進(jìn)行。FISH顯微鏡檢測(cè)參照文獻(xiàn)29實(shí)施，采用核苷酸探針包括：EUBI、EUBII、EUBIII及SolV830（5'-GGT GGA TTC GGC CAA GGC-3'），其中SolV830探針通過ARB程序30設(shè)計(jì)。pmoA mRNA表達(dá)通過RT-PCR技術(shù)分析。甲烷親和力采用批次培養(yǎng)細(xì)胞（OD600=0.24）進(jìn)行測(cè)定，氧表觀親和常數(shù)通過配備微呼吸系統(tǒng)（Unisense A/S）的1毫升玻璃反應(yīng)器中測(cè)量攪拌培養(yǎng)物的甲烷呼吸作用來評(píng)估。表1所列酶活性參照文獻(xiàn)23方法測(cè)定。

表1 Acidimethylosilex fumarolicum SolV菌株的C1代謝基因

通過焦磷酸測(cè)序組裝基因組后，鑒定出氯代謝相關(guān)基因。該組裝基于88.9 Mb的序列信息，以估計(jì)基因組大小2.5 Mb計(jì)算實(shí)現(xiàn)了35倍覆蓋度。基于已識(shí)別基因翻譯的蛋白質(zhì)序列，在莢膜甲基球菌基因組（http://pedant.gsf.de/）中進(jìn)行BLAST檢索。*部分基因（48個(gè)氨基酸）；與Prosthecochloris nestuuni的fo/D基因獲得最佳NCBI BLAST匹配（一致性51%；相似性71%；E值1.0×10-73）；與Burkholderia phytofirmans的gutQ基因（糖磷酸異構(gòu)酶家族）獲得最佳NCBI BLAST匹配（一致性45%；相似性66%；E值2.0×10-78）。

方法

3周后觀察到甲烷消耗，并開始將泥漿和混合土壤培養(yǎng)物重復(fù)系列轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基。最終將培養(yǎng)物系列稀釋并無菌過濾通過25 mm聚碳酸酯濾膜（0.2μm,Nucleopore），將其漂浮在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，并在密閉罐中在甲烷氣氛下培養(yǎng)17。1周后濾膜上出現(xiàn)微小的白色菌落，顯微鏡觀察僅顯示一種桿狀形態(tài)型。通過FISH和在頂空無甲烷的酵母提取物富集培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)檢查純度。在該培養(yǎng)基上未觀察到生長(zhǎng)。

培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基基于Fangaia礦物質(zhì)濃度組成：0.4 mM MgCl2、2 mM CaHPO4、1 mM Na2SO4、2 mM K2SO4、2 mM(NH4)2SO4、3%來自Pozzuoli的Fangaia泥漿池的無菌液體；1 ml l-1微量元素（以mg l-1計(jì)）ZnSO4·7H2O(4.4)、MnCl2·4H2O(1.0)、FeSO4·7H2O(1.0)、(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.22)、CuSO4·5H2O(0.32)、CoCl2·6H2O(0.32)。用H2SO4或NaOH調(diào)節(jié)pH。細(xì)菌在120 ml血清瓶中加入10 ml培養(yǎng)基生長(zhǎng)，頂空含2-5%CO2和2-5%CH4。瓶子在50-55°C、250 r.p.m.的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)。為確定反應(yīng)化學(xué)計(jì)量，用氣密注射器從三重培養(yǎng)物中取氣樣，并在配備Porapak Q柱和熱導(dǎo)檢測(cè)器的HP 6890氣相色譜儀上分析甲烷、二氧化碳、氧氣和氫氣。通過在指數(shù)生長(zhǎng)后期收獲細(xì)胞確定甲烷上的產(chǎn)率。細(xì)胞離心并用1 mM HCl洗滌，在70°C真空下干燥至恒重。