此處測試的所有微流體培養條件（1、5和20個胚胎，以及30和270納升的培養室體積）產生的囊胚率均高于90%，而相同胚胎組大小的傳統液滴培養產生的發育率顯著較低（30-75%），具體數值取決于胚胎組大小（圖2）。關于單胚胎培養，微流體方法被證明非常有前景，囊胚率約為95%，而液滴格式僅為較低的30%（圖2）。

接下來，考慮胚胎的全程發育，以確保所使用的體外培養條件不會損害胚胎。兩種培養平臺（微流體裝置和傳統液滴）的總體出生率相似，均約為30%（圖3）。然而，在檢查單胚胎培養時，發現微流體設置中的性能顯著更優（>30%對比液滴格式的20%），并且培養體積越小，出生率越高（圖3）。這些結果共同表明，使用限制性培養條件有利于胚胎生長，直至單個胚胎水平，這不僅體現在植入前階段，也體現在全程發育方面。這種由限制性帶來的優勢可以，例如，通過胚胎分泌促進其發育的生長因子這一事實來解釋，并且它們可以在納升腔內創建一個這些生長因子高濃度的微環境。相反，在較大體積中，這些生長因子被高度稀釋，因此導致胚胎發育受損或延遲，正如在液滴培養中觀察到的那樣。

III.用于人類胚胎體外培養的微流體系統

這種單胚胎培養方法和微流體平臺隨后在人類胚胎上進行了測試。微流體平臺的設計進行了升級，包括一個更大的培養室（約640納升）以容納人類胚胎（其大小大約是小鼠胚胎的兩倍），該裝置仍然使用相同的制造工藝由聚二甲基硅氧烷和玻璃生產。在此第二階段的驗證中使用了捐贈的人類胚胎（CCMO授權號NL38300.000.11），這些胚胎此前保存在液氮中。這些胚胎在發育第4天時被取出，首先解凍，然后在微流體裝置中以及作為對照，在覆蓋礦物油的25微升培養基液滴中培養長達72小時。總共有120個胚胎被納入研究，并隨機分配到微流體系統和傳統液滴中。在24、28、48和72小時的不同時間點對胚胎進行分級，評估其囊胚率和階段，以判斷其發育進程。

第二階段的驗證證實了聚二甲基硅氧烷微流體系統支持單個胚胎生長的能力。然而，兩種培養平臺發現了相似的生長率，并未看到微流體系統的明顯優勢（圖4）。與小鼠研究結果的這種差異可以解釋為，在第4天，人類胚胎已經經歷了其發育過程中的關鍵步驟；例如，基因組激活在8細胞階段（發育第3天）之前就已經發生。

IV.用于原位監測胚胎生長和發育能力的氧氣傳感器

作為開發用于單胚胎培養和表征的集成平臺的下一步，開發了一種氧氣傳感器。氧氣，作為胚胎代謝的整體標志物，已被公認為胚胎活力和發育能力的指標。我們開發了一種電化學傳感器，由一個作為工作電極的超微電極陣列組成。該傳感器的第一個原型包括16、25或36個超微電極的方形陣列，每個電極直徑為2微米，電極間距為20微米（圖5）。所有電極（超微電極陣列、對電極和參比電極）均在玻璃上由鉑制成，超微電極圖案化在氧化物-氮化物-氧化物絕緣層中。

首先，確定了溶解氧的還原電位，在磷酸鹽緩沖液中發現還原電位為-0.2伏。為了最小化電化學測量過程中的氧氣消耗，開發了一種創新的傳感方案。具體來說，施加一個短于5毫秒的-0.2伏脈沖，并連續測量還原電流。在這個短時間尺度上，超微電極周圍的擴散輪廓保持在線性狀態，因此傳感器行為遵循Cottrell方程。隨后，溶解氧濃度可以從以下公式推導出：

使用這種新型傳感原理，通過氮氣鼓泡改變溶解氧濃度，同時使用來自Unisense的商業傳感器監測傳感器響應以及實際的溶解氧濃度，對所提出的基于超微電極的傳感器進行了校準。對于36超微電極傳感器，發現溶解氧濃度與傳感器響應之間存在極好的線性相關性，靈敏度為0.49 nA.s^{-0.5}.L.mg^{-1}（圖6）。最后，評估了通過測量消耗的氧氣量；對于一個5毫秒的脈沖，大約消耗了63飛摩爾的氧氣，這顯著低于使用標準微電極時的消耗量。

接下來，將超微電極陣列傳感器集成到微流體裝置中，用于結合胚胎培養和表征。為此，改變了微流體裝置的設計，包括一個捕獲位點，用于在氧氣傳感器附近捕獲單個胚胎（圖7）。迄今為止，該集成傳感平臺僅在腫瘤球體上進行了測試，這些球體被用作胚胎的替代物，用于集成傳感平臺的第一階段驗證。將球體引入裝置后，使用集成傳感器和新型短測量時間方法隨時間監測其耗氧量。通常，在監測2小時后，測量到裝置內的溶解氧濃度相比大氣條件下降了約1毫克/升。下一步，該傳感裝置將在小鼠胚胎上進行測試。

V.結論

該項目的最終目標是開發一個集成平臺，用于基于非侵入性和代謝參數的單胚胎培養與表征相結合。為實現這一目標，第一步，我們實現并成功驗證了一個用于單胚胎培養的微流體平臺。經過調整后，同一平臺在捐贈的人類胚胎上進行了測試。同時，我們開發了一種由超微電極陣列組成的電化學傳感器，用于在培養室內原位監測胚胎的呼吸速率，作為其代謝和活力的整體標志物。我們特別提出了一種與該傳感器結合使用的新型傳感原理，以最小化電化學測量所消耗的氧氣量。目前的工作重點是將所提出的傳感器集成到培養微流體平臺中，在球體（用作胚胎替代物）上驗證整個平臺，然后才能在安全地在小鼠胚胎上評估該集成傳感平臺。