BNC管的生產

BNC管的生產在Bodin等人13和Hong等人16設計的兩種生物反應器中進行。簡而言之，第一個由Bodin等人描述的（縮寫為S-BNC生物反應器）通過將一根長硅膠管（外徑x壁厚：3x0.5 mm，長度14 cm）固定在玻璃管（直徑9x0.5 mm，長度13 cm）中心來組裝，用于制備S-BNC管，如圖1（A）所示。硅膠管和玻璃管之間長度為12 cm的空腔完全充滿約5 mL預培養物，長硅膠管的內腔連接一個空氣入口。第二個由Hong等人描述的（縮寫為D-BNC生物反應器）用于生產D-BNC管。D-BNC生物反應器由兩根硅膠管（直徑分別為3x0.5 mm和9x0.5 mm）組成，其中較細的管固定在較粗管的中心，如圖1（B）所示。將兩個生物反應器靜態放置在充滿氧氣（10 Pa）的容器中，在30°C下培養14天。

BNC管的純化

收獲的BNC管用超純水沖洗以去除可溶性成分，然后在80°C的1.0%（w/v）氫氧化鈉水溶液中孵育4小時以消除細菌細胞。之后，BNC管進一步用超純水洗滌以去除其他雜質，直至洗滌水的pH值為中性。然后將BNC管保存在4°C的超純水中。

溶解氧檢測

使用氧傳感器（Unisense OX-13896，丹麥）檢測溶解氧（DO）。簡而言之，將校準后的傳感器針尖浸入培養基中檢測初始DO 1分鐘，數據采集頻率為每分鐘120個數據。類似地，在培養第4天，將傳感器尖端插入生物反應器沿口徑方向的三個位置（IP：靠近內部硅膠管的位置，OP：靠近外部硅膠管或玻璃管的位置，以及MP：內外管之間的中間位置）以檢測氧濃度。選擇三個等效位置給出平均值。為了測量培養過程中培養液的DO變化，在不同時間點取樣，并在培養液快速擠出后立即進行檢測。進行三次平行測量。

細菌細胞分布表征

培養4天后，將BNC管從生物反應器中取出，并小心浸入組織最佳切割溫度（OCT）冷凍培養基（SAKURA Tissue-Tek®,USA）中20分鐘。使用冷凍切片機E儀器（Thermo Scientific,USA）制備厚度為50μm的切片標本。然后將標本轉移到孔徑為0.22μm的Nuclepore Track-Etch膜（Whatman®,Britain）上。用生理鹽水抽濾洗滌后，將標本在染色溶液（SYTO 9綠色熒光核酸染料，15μmol L-1溶于PBS，Thermo Fisher Scientific）中孵育30分鐘進行染色，未結合的染料通過PBS洗滌后真空過濾去除。使用熒光顯微鏡（Olympus BX53,Tokyo,Japan）拍攝標本的顯微照片。

糖消耗分析

為了確定BNC管培養過程中的糖消耗，每天取樣液體培養基樣品，并通過3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測定殘留的果糖或葡萄糖。測定進行三次。

BNC產量測定

BNC產量記錄每個純化管在105°C烘箱中干燥至恒重后的干重。平均值從三個樣品獲得。

BNC管形態表征

通過場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM,Hitachi-S4800）檢查BNC管的形態。將BNC管冷凍干燥并噴鍍碳層。FE-SEM圖像在5.0kV加速電壓下獲得。從SEM圖像中隨機選擇100根纖維，使用圖像分析軟件Image-J（NIH,USA）測量纖維直徑。然后根據獲得的數據計算平均直徑（MD）和纖維分布。

拉伸強度測量

將BNC管切成5厘米長，并在室溫超純水中保存24小時。拉伸強度測量參考了標準ISO 7198:1998(E)（已于2016年修訂）中描述的管狀樣品縱向拉伸強度測試程序。簡而言之，將BNC管在萬能材料試驗機（H5K,Hounsfield,UK）上用夾具夾住，夾距為3cm，以10mm min-1的速度和50 N傳感器負載測量軸向拉伸機械性能。拉伸測量進行三次。

爆破壓測量

使用自制設備測量爆破壓，該設備配備壓力表和注射器。將長度為4厘米的管狀樣品連接到設備上。以0.01 MPa s-1（75 mm Hg s-1）的速度將超純水注入管內直至失效。管內壓力每增加0.02 MPa保持10秒。記錄樣品突然破裂時的壓力。測量進行三次。

透水性測定

按照ISO 7198:1998(E)標準（已于2016年修訂）描述的方法測量透水性。簡而言之，記錄在0.016MPa測試壓力下，每分鐘透過BNC管（長度4厘米）管壁的水的體積。測量進行三次。

管密度測量

BNC管的密度通過將管的干重（w）除以濕管的實際體積（V）來測量：w/V[kg m-3]。為了測量實際體積，首先將管在20°C水中平衡24小時。然后將平衡后的管完全浸入放置在10mL量筒（最小刻度0.1 mL）中的5mL水中。管體積根據量筒中液位的變化獲得。干重在管于105°C干燥至恒重后測量。管密度的每個平均值從五個樣品獲得。

統計分析

進行單因素方差分析（ANOVA）以檢測收集數據的統計顯著性。P<0.05表示平均值之間存在顯著差異。