結(jié)果與討論

BNC管的生產(chǎn)

選擇兩種類型的生物反應(yīng)器，分別使用初始濃度為50 g L-1和100 g L-1的果糖和葡萄糖制備BNC管。如圖2所示，在同一類型的生物反應(yīng)器中，使用不同糖類型和初始濃度制備的培養(yǎng)液的初始DO沒有差異（P>0.05）。然而，D-BNC生物反應(yīng)器中的初始DO比S-BNC生物反應(yīng)器高約60%（1100-1143μmol L-1，而S-BNC生物反應(yīng)器中為684-697μmol L-1），這是因?yàn)橥獠抗枘z管界面提供了額外的氧氣補(bǔ)充。在培養(yǎng)過(guò)程中，兩種生物反應(yīng)器中四種類型培養(yǎng)基的DO在最初幾天迅速下降，然后在接下來(lái)的培養(yǎng)期保持恒定，表明在4-6天之前的早期階段，細(xì)菌的DO消耗速度快于DO供應(yīng)，然后達(dá)到平衡。然而，當(dāng)在培養(yǎng)基中使用兩種不同的糖時(shí)，不同生物反應(yīng)器中的DO水平變化不同。

如圖2（A）所示，在S-BNC中培養(yǎng)4天后，果糖培養(yǎng)基中的DO遠(yuǎn)低于葡萄糖培養(yǎng)基（72-94μmol L-1對(duì)比149-211μmol L-1）。較低的DO值意味著更高的代謝。不同的糖濃度在DO變化中沒有引起顯著差異。對(duì)于D-BNC培養(yǎng)（圖2（B）），與葡萄糖相比，果糖也實(shí)現(xiàn)了更快的代謝。葡萄糖濃度在DO變化中沒有引起大的差異。然而，由于D-BNC生物反應(yīng)器具有更高的氧氣供應(yīng)能力，最終的DO值（葡萄糖為765-784μmol L-1，果糖為421-553μmol L-1）遠(yuǎn)高于S-BNC培養(yǎng)（葡萄糖為149-211μmol L-1，果糖為72-94μmol L-1）。不同的是，當(dāng)使用果糖時(shí)，100 g L-1的濃度導(dǎo)致比50 g L-1更低的DO，表明細(xì)菌的生長(zhǎng)和BNC的合成是不同的。

BNC網(wǎng)絡(luò)的形成可能會(huì)鎖定大量的培養(yǎng)液在纖維網(wǎng)絡(luò)中，這可能會(huì)增加DO擴(kuò)散阻力。圖3顯示了使用100 g L-1果糖培養(yǎng)4天后兩種生物反應(yīng)器中的DO分布。在S-BNC生物反應(yīng)器中，靠近內(nèi)部硅膠管（IP）位置的DO為89.5±2.7μmol L-1，約為初始DO的13%。靠近外部管（OP）位置和兩管之間空腔中間位置（MP）的氧濃度分別約為11.0±1.8μmol L-1和16.2±6.9μmol L-1。盡管在培養(yǎng)過(guò)程中氧氣通過(guò)內(nèi)部硅膠管流入，但OP和MP處嚴(yán)重的缺氧環(huán)境可能是由S-BNC纖維網(wǎng)絡(luò)中的DO擴(kuò)散限制和細(xì)菌的高耗氧量引起的。在D-BNC生物反應(yīng)器中，由于外部硅膠管提供了額外的氧氣供應(yīng)，IP和OP處的溶解氧分別約為191.6±10.4μmol L-1和458.3±20.1μmol L-1。OP處較高的DO意味著由于更大的表面積，從外部硅膠管獲得了更多的氧氣供應(yīng)。與S-BNC管培養(yǎng)相比，IP處較高的DO也可能歸因于更多的氧氣供應(yīng)。然而，MP處的DO水平仍然較低（8.13±1.9μmol L-1），原因與S-BNC生物反應(yīng)器相同。

沿口徑方向的不均勻DO分布可能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的不同分布。為了研究這一點(diǎn)，制備了培養(yǎng)4天時(shí)BNC管的冷凍切片，并應(yīng)用SYTO 9綠色熒光核酸染料使細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。如圖4所示，在未純化的S-BNC和D-BNC標(biāo)本的冷凍切片圖像中，分別發(fā)現(xiàn)了一個(gè)和兩個(gè)與強(qiáng)綠色熒光相關(guān)的區(qū)域。結(jié)果表明，在靠近硅膠管支撐物（可視為氣液界面）處存在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞區(qū)，因?yàn)闊晒馊玖蟂YTO 9可以特異性結(jié)合細(xì)胞的DNA和RNA并發(fā)出強(qiáng)熒光。這一發(fā)現(xiàn)與靜態(tài)培養(yǎng)中只有氣液界面的細(xì)菌才能保持其活性的事實(shí)相符。15與S-BNC管制備中僅在內(nèi)部硅膠管附近出現(xiàn)一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞區(qū)不同，在D-BNC管制備中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞區(qū)。該結(jié)果有力地驗(yàn)證了Hong等人16報(bào)道的在兩個(gè)硅膠管表面形成兩個(gè)BNC層的結(jié)果。靠近硅膠管表面的區(qū)域中細(xì)菌細(xì)胞的聚集分布應(yīng)導(dǎo)致在硅膠管周圍產(chǎn)生更多的BNC，這可能會(huì)限制氧氣向遠(yuǎn)離硅膠管表面的更遠(yuǎn)距離擴(kuò)散。并且聚集的細(xì)菌細(xì)胞可能快速消耗DO。所有這些結(jié)果使得氧氣分布更加不均勻。因此，來(lái)自兩種類型生物反應(yīng)器的BNC管中的纖維分布可能不同。

選擇培養(yǎng)4天的樣品進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞分布表征基于以下方面。在4天之前，S-BNC管尚未形成。因此，不可能制備切片標(biāo)本來(lái)分析細(xì)胞分布。在培養(yǎng)4天后，研究中未檢測(cè)到不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞分布輪廓的顯著差異。最重要的是，根據(jù)微生物學(xué)中的典型生長(zhǎng)曲線，細(xì)菌細(xì)胞在培養(yǎng)4天時(shí)最為活躍，這在DO和殘留糖的變化曲線（圖2和圖5）中顯示在大約4天的時(shí)間點(diǎn)有一個(gè)拐點(diǎn)。

分別研究了50 g L-1和100 g L-1的葡萄糖和果糖作為碳源，用于兩種生物反應(yīng)器中的BNC管生產(chǎn)。圖5說(shuō)明了木醋桿菌在兩種生物反應(yīng)器中培養(yǎng)期間糖消耗的變化。結(jié)果表明，在相同初始濃度下，葡萄糖的消耗速度快于果糖。在初始濃度為50 g L-1葡萄糖的條件下，培養(yǎng)14天后，S-BNC和D-BNC生物反應(yīng)器中的殘留濃度分別降至10.8 g L-1和7.9 g L-1。在初始濃度為50 g L-1時(shí)，殘留果糖濃度僅分別降至約38.7 g L-1和23.1 g L-1（圖5（A））。D-BNC培養(yǎng)比S-BNC消耗更多的糖。如上所述，D-BNC生物反應(yīng)器的氧氣供應(yīng)更好，這可能有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，消耗了更多的糖。

圖6（A）顯示了使用50 g L-1糖進(jìn)行BNC管培養(yǎng)期間pH值的變化。當(dāng)使用50 g L-1葡萄糖時(shí)，兩種BNC管培養(yǎng)過(guò)程中的pH值在3天后迅速降至約2.5，并保持恒定至14天。然而，使用50 g L-1果糖的D-BNC培養(yǎng)中的pH在4天后降至約4.2，然后變得恒定。相同條件下S-BNC培養(yǎng)中的pH在6天后降至約4.4。pH變化的趨勢(shì)與糖消耗相對(duì)應(yīng)。先前的研究表明，酸是BNC培養(yǎng)中的副產(chǎn)物，導(dǎo)致pH降低。21當(dāng)使用葡萄糖作為碳源時(shí)會(huì)產(chǎn)生更多的酸，隨后較低pH嚴(yán)重限制了BNC的分泌。21使用50 g L-1果糖培養(yǎng)14天后，S-BNC和D-BNC管的最終產(chǎn)量分別為0.75±0.10 g L-1和3.05±0.28 g L-1，而使用50 g L-1葡萄糖作為碳源的BNC產(chǎn)量分別為0.46±0.04 g L-1和1.01±0.09 g L-1（圖7）。

結(jié)果表明，果糖更適用于兩種生物反應(yīng)器中的BNC生產(chǎn)。果糖BNC合成過(guò)程中較低的pH變化對(duì)BNC生產(chǎn)的負(fù)面影響較小，因此D-BNC管的產(chǎn)量高于使用葡萄糖和果糖生產(chǎn)的S-BNC，這與更多的糖消耗一致。這是因?yàn)锽NC基質(zhì)可以在D-BNC生物反應(yīng)器中從兩個(gè)方向形成，而在S-BNC生物反應(yīng)器中，BNC僅作為模板在單個(gè)硅膠管表面形成。13此外，D-BNC生物反應(yīng)器中更好的氧氣供應(yīng)可能有助于提高產(chǎn)量。